Eksplorasi, Menghitung Kerapatan Spora, Pembuatan Isolat, Starter Trichoderma sp. Sebagai Kegiatan Perbanyakan Trichoderma sp.

Jamur Trichoderma sp. merupakan salah satu jamur yang dapat tumbuh di tanah sebagai pupuk biologis dan agens pengendalian hayati terhadap mikroba lainnya khususnya dari kelompok penyakit pathogen tanaman.

Pada habitatnya jamur Trichoderma sp. banyak ditemukan di tanah subur yang mengandung bahan organik dengan lingkungan lembab atau tidak terkena sinar matahari langsung seperti pada ekosistem hutan, perakaran bambu dan tanah subur lainnya. Lingkungan tanah dengan kriteria tersebut, jamur Trichoderma sp. dapat di ekslporasi dengan cara mengambil sampel tanah kemudian dilakukan isolasi dan pemurnian pada media PDA (Potato Dextrose Agar) dengan teknik dilution atau pengenceran bertingkat terhadap sampel tanah.

Jamur Trichoderma sp masuk dalam klasifikasi sebagai berikut:

Kerajaan: Fungi
Divisi: Ascomycotina
Kelas: Sordariomcetes
Ordo: Hypocreales
Famili: Hypocreaceae
Genus: Trichoderma
Spesies: Terdapat beberapa spesies: T. koningii, T harzianum, T viride

Morfologi koloni Trichoderma sp. sangat tergantung pada media tempat tumbuhnya. Pada media yang nutrisinya lebih banyak, koloni dapat terlihat lebih putih. Konidia dapat terbentuk dalam satu minggu, warnanya dapat kuning, hijau atau putih. Trichoderma sp. merupakan salah satu jenis jamur yang dapat menjadi agen pengendali hayati atau biokontrol karena bersifat antagonis bagi jamur lainnya, terutama yang bersifat pathogen. Aktivitas antagonis yang dimaksud dapat meliputi, persaingan, parasitisme, predasi atau pembentukan toksin seperti antibiotik. Jenis Trichoderma harzium dapat memproduksi metabolit seperti asam sitrat, etanol, dan berbagai enzim seperti urease, selulase, glukanase dan kitinase.

A. Eksplorasi

Metode isolasi tanah hasil eksplorasi yang sering digunakan adalah metode pengenceran, dengan metode ini akan mudah nantinya dilakukan pemurnian, dikarenakan jamur tumbuh dalam bentuk koloni tunggal. Adapun langkah- langkah dalam metode pengenceran anyara lain:

Sampel tanah yang diperoleh dari lapang disekitaran perakaran tanaman yang sehat diketakan diatas nampan untuk dikeringkan, kemudian sampel tanah dibersihkan, dan dihaluskan dengan diayak.

Sampel tanah ditimbang sebanyak 1 gram dan dimasukan ke dalam erlenmeyer berukuran 100 ml.

Aquades ditambahkan kedalam erlenmeyer yang berisi sampel tanah hingga volume 100 ml (pengenceran 10 pangkat 1) dan pada erlenmeyer di shake selama 15 menit menggunakan magnetic stirrer

Menyaipkan tabung reaksi yang berisi aquades sebanyak 9 ml, kemudian mengambil 1 ml suspensi menggunakan jarum syringe, dan dimasukan kedalam tabung reaksi yang telah berisi 9 ml aquades (pengnceran 10 pangkat 2)

Kemudian, tabung reaksi yang telah berisi suspensi di shake selama 3 menit menggunakan vortex
Mengambil 1 ml suspensi dalam tabung reaksi dan dimasukan kedalam tabung reaksi berisi 9 ml aquades (pengenceran 10 pangkat 3) begitu seterusnya hingga pengenceran yang diinginkan. Setelah pengnceran yang diinginkan (10 pangkat 3), suspensi diambil sebanyak 0,1 ml dengan jarum syringe, dan diletakan didalam petridish yang telah berisi media PDA secara aseptis dan diratakan dengan drigalsi.

Kemudian, warp dan beri label pada setiap cawan petri kemudian diinkubasi selama 3-4 hari dalam suhu ruang.
Pertumbuhan jamur diamati setiap hari, pemurnian dilakukan hingga jamur yang diisolasi murni.

Gambar. Isolat hasil eksplorasi tanah perakaran tomat

Setelah dimurnikan, isolat jamur diidentifikasi berdasarkan literatur baik secara makroskopis melalui karakteristik koloni jamur dan mikroskopis dengan menggunakan mikroskop.

Gambar. Isolat yang telah dimurnikan dan diidentifikasi didapatkan jenis Trichoderma viride pada sampel tanah sekitar perakaran tomat.

B. Pembuatan Isolat Trichoderma sp.

Pembuatan isolat untuk perbanyakan Trichoderma sp ini umumnya menggunakan media PDA ( potato dextrose agar), yang khusus digunakan untuk pertumbuhan jamur. Media PDA ini terdapat kentang dan dextrose sebagai nutrisi utama pertumbuhan jamur. Media ini juga ditambahkan agar sebagai bahan pemadat. Berikut adalah cara membuat isolat PDA untuk perbanyakan jamur Trichoderma sp.

Sterilisasi botol dan kapas dan menyiapkan bahan- bahan

Memilih kentang dengan kondisi yang bagus. Kentang di kupas dan dipotong bentuk dadu dengan ukuran 2 x 2 cm.

Kentang direbus didalam panci berisi aquades sebanyak 500 ml hingga didapatkan ekstrak kentang. Menimbang dextrose dan agar - agar sebanyak 20 gram

Setelah direbus, air kentang disaring

Masukan dextrose sebanyak 20 gram dan agar sebanyak 20 gram ke dalam ekstrak kentang, aduk hingga tidak ada yang menggumpal dan tambahkan aquades hingga volume 1000 ml
Selanjutnya berikan chloramphenicol jika PDA sudah sedikit hangat, yang bertujuan untuk mencegah adanya bakteri.
Masukan PDA pada botol kultur yang telah disterilisasi sebelumnya secara perlahan

Kemudian media PDA dalam botol kultur di sterilisasi kembali
Dinginkan botol yang telah berisi PDA dan setelah media memadat jamur Trichoderma dapat di inokulasi.

Setelah diinokulasi, isolat dapat diamati 7-10 hari hingga spora jamur Trichoderma memenuhi permukaan media PDA dalam botol. Isolat Trichoderma sp. yang telah ada selanjutnya di uji kerapat spora untuk mengetahui kelayakannya untuk digunakan sebagai starter Trichoderma menggunakan media beras.

C. Menghitung Kerapatan Spora Isolat Trichoderma sp.

Menghitung kerapatan spora dilakukan untuk mendapatkan jamur agens pengendali hayati Trichoderma sp. Memenuhi standar hal yang dapat dilakukan terlebih dahulu adalah mengetahui kerapat spora dari jamur Trichoderma sp yang telah didapatkan setelah eksplorasi dan pemurnian. Oleh karena itu, kita perlu mengetahui cara menghitung kerapatan spora sebagai berikut.

Haemocytometer tipe neubauer improved disiapkan, diletakan pada meja benda mikroskop, ditutup dengan gelas penutup Haemocytometer.
Melakukan pengnceran bertingkat hingga 10 pangkat -3 yang diambil dari isolat Trichoderma sp. yang sebelumnya telah diisi aquades sebanyak 10 ml, aduk hingga homogen dalam botol isolat
Setiap tingkat pengenceran dilakukan pengadukan dengan alat vortex selama 3 menit.
Kemudian suspensi dengan pengenceran 10 pangkat -3 diambil 0,2 ml menggunakan jarum syringe
Suspensi spora jamur Trichoderma sp diteteskan secara perlahan pada bidang hitung dengan syringe melalui kedua kanal pada sisi atas dan bawah, hingga bidang hitung terpenuhi suspensi secara kapiler, didiamkan 1 menit agar posisi stabil
Diamati dengan pembesaran 100x untuk mendapatkan bidang hitung pada Haemocytometer
Pengamatan diulangi untuk memperoleh fokus pada spora dan bidang hitung
Kerapatan spora yang terdapat pada kotak hitung (a+ b + c+ d + e) dengan pembesaran 400x
Keterangan: Kotak pada gambar di atas dengan luas 1 mm x 1 mm = 1 mm pangkat 2, dibagi menjadi 25 kotak, sehingga kotak a, b, c, d, e masing- masing memiliki luas 0,2 mm x 0,2 mm = 0,04 mm pangkat 2. Berikut merupakan gambar Alur perhitungan kerapatan spora.
Spora yang terletak pada garis batas kotak hitung hanya dihitung pada sisi kiri dan kotak hitung tersebut, sedangkan proses penghitungannya seperti gambar dibawah ini.
Keterangan: A= spora yang dihitung, B = spora yang tidak dihitung
Setelah diketahui banyak spora pada kota perhitungan, jumlah spora/ml dihitung dengan cara sebagai berikut.

Keterangan:

S = kerapatan spora/ ml

X = rerata jumlah spora pada kotak (a,b,c,d,e)

L = luas kotak hitung (0,04 x 5 = 0,2 mm pangkat 2)

t = kedalaman bidang hitung 0,1 mm

d = faktor pengnceran

10 pangkat 3 = volume suspensi yang dihitung (konstanta)

D. Pembuatan Starter dengan Media Beras dalam perbanyakan Trichoderma sp.

Trichoderma sp. merupakan salah satu jenis cendawan yang ada di rizosfer yang mampu melindungi tanaman dari patogen dan meningkatkan kesuburan pertumbuhan tanaman sehingga dapat digolongkan sebagai biofertilizer dengan menguraikan fosfat dari Al, Fe, dan Mn, serta mampu memacu pertumbuhan vegetatif dan generatif tanaman dengan meningkatkan jumlah biji. Trichoderma sp. ini memiliki sifat antagonis tinggi terhadap jamur patogen seperti Fusarium sp., Phytophtora sp., dan lainnya yang mudah diisolasi dan dibiakan, mikroparasitismenya luas, dapat tumbuh dengan cepat pada berbagai substrat, sehingga dapat digunakan sebagai agen pengendalian hayati (pestisida hayati) yang mampu menekan jamur patogen. Trichoderma sp. dapat diperbanyak pada berbagai media antara lain PDA, ataupun media beras dengan cara yang mudah sebagai berikut.

Menyiapkan beras dan cuci hingga bersih
Memasak beras menggunakan panci, dengan cara mengukus beras setelah air mendidih
Kemudian ditiriskan beras tadi, kemas dalam plastik tahan panas ukuran 1 kg. Memasukan beras hingga memenuhi 1/4 bagian plastik tersebut. Setelah itu dilipat mengelilingi bagian kemasannya membentuk persegi panjang.
Masukan beras yang sudah di kemas ke dalam panci dan kukus kembali hingga 15 menit yang dihitung setelah air mendidih, kemudian matikan kompor dan dinginkan.
Menyiapkan enkas yang telah dibersihkan dan steril dengan menggunakan alkohol.
Setelah media beras dingin maka dapat diinokulasi jamur Trichoderma sp. dengan cara botol isolat Trichoderma sp. diencerkan menggunakan aquades 50 ml yang kemudian dituang pada media beras
Menutup kemasan tersebut yang telah diberi Trichoderma sp. cair dengan cara melipat mulai dari bagian ujung atas kemasan menuju kebawah dengan staples dan membuat bentuk segitiga untuk memberikan ruang untuk media beras di dalam kemasan selama pertumbuhan Trichoderma sp.
Setelah 7 hingga 14 hari maka media beras dalam kemasan akan ditumbuhi jamur Trichoderma sp. yang ditandai dengan warna hijau. Jika yang tumbuh pada media tersebut selain warna hijau, maka itu bukan jamur Trichoderma sp. yang tumbuh melainkan terdapat kontaminasi dari jamur lainnya.
Media beras yang telah ditumbuhi jamur Trichoderma sp. dapat diperbanyakan pada media pupuk kompos yang telah difermentasi dengan mencampurkannya dengan perbandingan 1 ; 1000.